近日，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物基因工程与种质创新科技创新团队联合深圳农业基因组研究所动物基因组中心，成功建立了一种名为报告RNA富集的双引导RNA核蛋白（reporter RNA enriched dual-sgRNA/CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins，RE-DSRNP）高效编辑技术体系，可用于快速制备无外源DNA（Transgene-free）基因编辑克隆猪，并利用该体系成功获得了 WIP1 基因编辑的雄性繁殖障碍模型猪。相关研究成果发表在《中国科学:生命科学（Science China:Life Sciences）》上。

基因编辑猪在农业和医学等领域具有重要的应用价值，然而，制备基因编辑猪的过程中还存在诸多问题。例如，难以快速获得大量基因型一致的个体，质粒DNA可能随机整合到细胞的基因组，单克隆细胞筛选过程可能降低供体细胞的质量等。

为了完善基因编辑猪的制备过程，研究人员使用双引导RNA，提高了编辑精度和效率；使用核糖核蛋白（RNP）编辑系统，成功避免了质粒DNA整合到基因组的风险，实现了低脱靶、低毒、Transgene-free编辑；将报告RNA富集系统与DSRNP有机结合，使核移植供体细胞的培养时间由3~4周缩短为1周，而且显著降低了供体细胞发生凋亡和染色体异常的比例。为了验证RE-DSRNP在创制基因编辑克隆猪上的应用效果，研究人员以高繁殖力著称的我国地方猪种——梅山猪为材料，利用RE-DSRNP体系靶向编辑 WIP1 基因。结果表明，在获得的32头断奶克隆猪中，有31头为 WIP1 基因编辑型，15头为预期的38bp DNA片段缺失纯合子类型，所有的克隆猪均未检测到脱靶，且 WIP1 基因编辑猪表现出明显的雄性繁殖障碍表型。

图 RE-DSRNP高效编辑技术体系及其在制备WIP1基因编辑雄性繁殖障碍模型猪中的应用

体细胞克隆基因编辑技术是目前动物生物育种和医学模型研发的主流技术。该研究建立的RE-DSRNP体系，可显著降低脱靶和非预期效应，极大提高编辑效率，缩短制备时间，在猪和其他大动物的生物育种以及医学模型研发方面具有广阔的应用前景。此外，种公猪对母猪繁殖力具有决定性作用，在育种体系和商品生产中举足轻重，该研究首次构建了 WIP1 基因编辑猪模型，对于深入研究雄性繁殖机制具有重要意义。

该研究得到国家自然科学基金、国家转基因生物新品种培育重大专项和中国农科院科技创新工程等项目的资助。中国农业科学院北京畜牧兽医研究所徐奎、张秀玲和刘志国为文章的共同第一作者，牟玉莲和李奎为通讯作者。

原文链接：https://doi.org/10.1007/s11427-021-2058-2